前 言

提高蛋白質(zhì)功能及其穩(wěn)定性，對合成生物學(xué)、生物制藥等產(chǎn)業(yè)具有重要意義。通過引入定點(diǎn)突變，改變蛋白質(zhì)中某個位置的氨基酸，可以提升蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或催化性能。

無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)利用從細(xì)胞中分離的翻譯機(jī)制進(jìn)行模板基因的體外表達(dá)。由于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)無需基因克隆和細(xì)胞培養(yǎng)步驟即可產(chǎn)生蛋白質(zhì)，因此可作為酶庫高通量表達(dá)的通用平臺。運(yùn)用無細(xì)胞蛋白合成技術(shù)，可以在微孔板中高通量合成相應(yīng)蛋白，與后續(xù)基于微孔板的高通量檢測步驟能夠無縫銜接，從而實(shí)現(xiàn)包括基因構(gòu)建、蛋白表達(dá)、檢測篩選在內(nèi)的全流程高通量蛋白快速篩選。此外，無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成不需要維持細(xì)胞活力或膜完整性，因此可以更靈活地設(shè)計酶結(jié)構(gòu)，提升酶活性 [1]。

珀羅汀生物基于自主研發(fā)的無細(xì)胞蛋白技術(shù)，利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑開發(fā)了高通量篩選應(yīng)用場景，技術(shù)團(tuán)隊(duì)以綠色熒光蛋白(GFP)為模型，在 13 小時內(nèi)完成了近百個定點(diǎn)突變蛋白的高通量制備及表達(dá)驗(yàn)證，快速獲得高性能的蛋白突變體。

實(shí)驗(yàn)方法

定點(diǎn)突變

首先我們向GFP原始基因序列中分別引入95種定點(diǎn)突變(圖1)。通過使用帶有突變基因的引物對原始模板進(jìn)行PCR的方式，將突變引入PCR產(chǎn)物當(dāng)中，再用Dpn I 酶將原始模板質(zhì)粒降解后，使用Seamless法將線性模板重新連接為環(huán)狀。達(dá)到獲得環(huán)狀且?guī)в型蛔儼被岬鞍谆虻哪康摹?/p>

圖1. 定點(diǎn)突變基因表達(dá)載體的構(gòu)建流程

無細(xì)胞蛋白表達(dá)反應(yīng)

構(gòu)建完成突變基因載體后，我們進(jìn)一步對載體進(jìn)行體外擴(kuò)增和高通量蛋白表達(dá)(圖2)。取少量連接完的帶有突變的環(huán)化模板，按照推薦的步驟，進(jìn)行線性模板的PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的線性模板加入無細(xì)胞蛋白反應(yīng)液后，進(jìn)行無細(xì)胞反應(yīng)。該步驟極大的減少了蛋白表達(dá)所需求的時間，在2-8h內(nèi)就能在反應(yīng)體系中生成目的蛋白。該技術(shù)操作簡便，極易與自動化工作站相結(jié)合。同時由于沒有細(xì)胞膜的限制，離心后的表達(dá)上清即可進(jìn)行后續(xù)酶的活性檢測，進(jìn)一步簡化實(shí)驗(yàn)流程以達(dá)到節(jié)約人力及時間成本的目的。

圖2.突變基因擴(kuò)增與無細(xì)胞蛋白表達(dá)

整體操作流程

通過上述方法，即可在13小時以內(nèi)，完成近100個突變蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)篩選。其中人工操作時間累計僅30分鐘，占全部時間的比例不到4%。運(yùn)用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，結(jié)合PCR、光學(xué)檢測等，實(shí)現(xiàn)了全流程的體外高通量篩選實(shí)驗(yàn)，顯著了縮短了實(shí)驗(yàn)時間，減少了人員工作量，這為加快研發(fā)周期，降低人力成本提供可能。

圖3.無細(xì)胞蛋白表達(dá)篩選流程的時間與試劑成本分析

突變體篩選結(jié)果

我們在綠色熒光蛋白活性中心的5個位點(diǎn)上(第64-69位氨基酸)，分別引入定點(diǎn)突變，每個位點(diǎn)均包括了所有可能的氨基酸(19種)，總計95種突變體。我們在96孔板上完成了基因構(gòu)建、蛋白表達(dá)和熒光檢測分析，通過熒光信號檢測，我們獲得95種突變體對應(yīng)的熒光值(圖4)。突變相應(yīng)位點(diǎn)氨基酸能顯著改變蛋白的熒光特性。我們發(fā)現(xiàn)將GFP第66位的酪氨酸替換為組氨酸，原來的綠色熒光波長發(fā)生藍(lán)移(圖5)，有成為eBFP(增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白)的潛力。將GFP第66位的酪氨酸替換為色氨酸，同樣也能使得GFP的熒光波譜藍(lán)移，但藍(lán)移幅度略低于前述替換為組氨酸(圖6)，故該突變體有成為eCFP(增強(qiáng)型青色熒光蛋白)的潛力。

圖4.定點(diǎn)突變GFP在535nm波長的綠色熒光強(qiáng)度

圖5.定點(diǎn)突變GFP的450nm波長的藍(lán)色熒光強(qiáng)度

圖6.定點(diǎn)突變GFP的480nm波長的青色熒光強(qiáng)度

總結(jié)及展望

通過上述實(shí)驗(yàn)，珀羅汀生物展示了一種運(yùn)用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，高通量篩選驗(yàn)證點(diǎn)突變蛋白的方法。該方法在13小時內(nèi)完成了近百種突變蛋白的構(gòu)建表達(dá)及活性驗(yàn)證，顯著縮短了蛋白篩選的時間，減少了人工操作，提高了研發(fā)效率。蛋白生物活性、穩(wěn)定性的不斷提升，對于蛋白類產(chǎn)品在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、造紙、紡織、生物能源、家庭護(hù)理等方面推廣應(yīng)用，有著舉足輕重的作用。運(yùn)用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，能夠更高效快速地完成蛋白質(zhì)改造與篩選，縮短酶制劑、蛋白藥物等各類蛋白產(chǎn)品的研發(fā)周期，降低研發(fā)成本，從而促進(jìn)新型重組蛋白、酶、抗體等蛋白產(chǎn)品快速的發(fā)展。

珀羅汀生物作為一家專業(yè)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)生物技術(shù)公司，將繼續(xù)利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)優(yōu)勢，開發(fā)更為廣泛的應(yīng)用場景。